酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）原理與分類

更新時間：2024-06-25

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原理：

酶標(biāo)抗體法，又名酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），利用酶標(biāo)記抗原或抗體以檢測相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。其基本原理是使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性，而相對應(yīng)的抗體或抗原與某種酶連接成酶標(biāo)抗體或抗原，酶標(biāo)抗體或抗原既保留了免疫活性可以與固相載體表面的抗原或抗體結(jié)合，又保留了酶活性能夠以酶為檢測信號，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與受檢抗體或抗原的量成比例，故可根據(jù)顏色深淺來定性或定量分析。酶標(biāo)抗體法具有靈敏性強(qiáng)，特異性高，重復(fù)性好，檢測速度快的特點(diǎn)，尤其適用于大批量樣本檢測，是國際認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)化診斷方法。

基本操作步驟：

包被—封閉—加樣—孵育一抗—洗滌—孵育二抗—洗滌—顯色—終止—讀數(shù)

分類：

依據(jù)檢測目的不同，酶標(biāo)抗體法有間接法，雙抗體夾心法，競爭法和抗體捕獲法等。

1.間接法

主要是利用酶標(biāo)記的抗抗體檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，是檢測抗體常用的方法。將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原，洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。加入稀釋的受檢樣品（如血清），樣品中特異性抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。加入酶標(biāo)抗抗體與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。最后加底物顯色，依據(jù)顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。

2.雙抗體夾心法

檢測抗原常用的方法。將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。加受檢標(biāo)本，使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。加酶標(biāo)抗體使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合，洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體，此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。

3.競爭法

可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌后加入受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會與固相抗體結(jié)合，競爭性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原，孵育后酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)最充分的量。洗滌后加底物顯色，參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測管顏色越淺，表示標(biāo)本中抗原含量越多。

4.抗體捕獲法

血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗體多用捕獲法。先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，去除IgG后再測定特異性IgM。將抗IgM抗體連接在固相載體上，洗滌后加入稀釋的血清標(biāo)本，洗滌后加入特異性抗原，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，最后洗滌加底物顯色。

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